博鱼肿瘤细胞具有与正常细胞相同的表面抗原。然而，它们也携带一些其他的抗原，这些抗原在非肿瘤细胞上不表达或表达量极少。它们被称为肿瘤特异性或肿瘤相关抗原（图1）。肿瘤抗原是由大约8-10个氨基酸组成的肽链和主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类和Ⅱ类构成，瘤内或区域淋巴结中的树突状细胞捕获这些肽链，并将其提呈给细胞毒性CD8+T细胞，从而导致这些细胞增殖和活化（图2）。活化细胞毒性T细胞（ATC）从全身循环中返回并渗透到肿瘤微环境中。它们与相应的肿瘤抗原结合并破坏肿瘤细胞。
图 1. 图示正常细胞的表面抗原，及相对于正常细胞，癌细胞除具有正常抗原外，表面还附有肿瘤特异性和肿瘤相关抗原（显示为黄红色）。
图 2. 树突状细胞捕获和提呈肿瘤抗原，并将这些抗原以多肽的形式与细胞表面的MHC结合。T淋巴细胞上的T细胞受体与MHC多肽复合物相互作用。除了与MHC多肽复合物结合外，T细胞还需要第二个信号才能被活化。淋巴细胞上的 CD28 与树突状细胞表面的 B7 结合，这种相互作用刺激T细胞加速成为活化的T细胞（ATC）。
在正常情况下，免疫系统的作用是保护宿主免受传染病和肿瘤的侵害。此外，它在清除不健康和病变的细胞过程中起着至关重要的作用。然而，过度活跃的免疫系统可能会引起自身免疫，导致不同程度的组织损伤。免疫检查点是免疫系统的抑制调节器，通过控制免疫反应的持续时间、范围和强度，最大限度地减少组织损伤，对保持自我耐受性和预防自身免疫至关重要。其中一个检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA4）。它在调节性T细胞（Tregs）中表达，并在活化的T细胞中表达上调。CTLA4与T细胞共刺激蛋白CD28具有相似性，两种分子都争相与CD80（B7）结合。CTLA4，当由CD80激活时，将抑制信号传输到T细胞，而CD28则传输刺激信号（图2和3）。另一对细胞表面蛋白，即程序化细胞死亡1（PD-1）/程序化细胞死亡配体1（PD-L1），在正常免疫检查功能中起着至关重要的作用。
图3.活化的T细胞表面的 CTLA4 与 CD28 竞争性结合树突状细胞的B7，导致T细胞发生退化和失活。
PD-1 （CD279） 是一种由288个氨基酸组成的I型跨膜蛋白，主要表达在外周组织中被抗原活化的记忆 T 细胞上，很少在B细胞、活化的单核细胞、树突状细胞（DC）和自然杀伤（NK）细胞上表达。PD-1与B7蛋白受体家族同源，由免疫球蛋白V（IgV）样胞外结构域和包含两个磷酸化位点的胞内结构域（图4）组成。
图4. 图示PD-L1在肿瘤细胞上的结构，PD-1在活化的T细胞表面表达。
PD-L1（B7-H1或CD274）是一种由290个氨基酸组成的蛋白，是I型跨膜蛋白受体中B7家族成员，包括两个胞外结构域，即IgV样和IgC样结构域：一个跨膜域和一个胞内结构域（图4）。这种蛋白质在许多类型的细胞上都有表达，包括抗原提呈细胞（APC）、T细胞、B细胞、单核细胞和上皮细胞。在被促炎性细胞因子活化后，这些细胞上调PD-1表达。此外，PD-L1与PD-1的结合激活了T细胞中PD-1受体的下游信号，从而抑制了T细胞的增殖、细胞因子生成、释放和细胞毒性（图5）。
图5. PD-L1 与 PD-1 在活化的T细胞表面上结合，伴随T细胞受体和MHC的共同刺激，导致淋巴细胞失活。
免疫检查点的生理作用是防止免疫反应过程中对自身抗原的有害免疫攻击。每个检查点通路通过细胞内信号机制减少免疫活化博鱼·体育官网，从而通过诱导T细胞退化和耗竭来对受体免疫细胞进行负反馈调节。抑制性检查点蛋白，包括程序化PD-1、PD-L1或CTLA-4，可以抑制抗肿瘤T细胞反应。优化处理这些检查点蛋白是治疗某些肿瘤的常见策略，如非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤或尿道癌。通过上调PDL1表达，这些肿瘤使用上述一些通路作为关键机制来失活细胞毒性T细胞，从而逃避抗肿瘤免疫反应。
活化的T细胞渗入肿瘤内破坏肿瘤细胞（图6）。在肿瘤细胞和活化的T细胞相互作用中、释放出一些促炎细胞因子（IFNγ、TNF-α、IL-4和IL-2）到肿瘤微环境中，导致肿瘤细胞发生免疫调控，上调表达PD-L1到肿瘤细胞膜上（图7）。此外，肿瘤周围免疫细胞，包括活化的T细胞、抗原提呈细胞和树突状细胞，也上调了PD-L1在其细胞膜上的表达。PD-1 在活化的T细胞表面组成型存在。当PD-L1存在于肿瘤细胞上，并且与一些免疫细胞上的PD-1相互作用时，它传递负反馈协同刺激信号，导致活化的T细胞处于灭活、休眠和退化状态。这些变化使肿瘤绕过免疫系统，并最终进展，播散和转移。这些失活的T细胞在肿瘤微环境中仍然持续受到抑制，但促炎性的微环境也吸引调节性T细胞，帮助维持T细胞退化和休眠（图8）。这些变化使肿瘤细胞绕过免疫系统，并继续进展。
图6. 活化的淋巴细胞侵入肿瘤微环境，寻找癌细胞进行破坏。为了杀死癌细胞，活化的T细胞产生促炎性细胞因子，它们可以逐步积累并改变肿瘤的微环境。最后，癌细胞会增加PD-L1在细胞膜上的表达。
图7. 癌细胞上的PD-L1与淋巴细胞上的PD-1相互作用导致淋巴细胞失活，并增加调节性T细胞的数量，从而提供免疫抑制环境。
图8. 由于免疫抑制环境，癌细胞可以绕过免疫系统增殖并进展。失活的T细胞持续存在，并被调节性T细胞保持在非活化状态。
通过一些生物过程，肿瘤细胞表面的PD-L1可能会变为阳性或阴性。肿瘤周围T细胞诱导肿瘤细胞表达PD-L1，T细胞的缺乏可能导致反应性PD-L1表达缺失。遗传因素可能决定PD-L1表达的组成型表达。肿瘤细胞内基因变异，可能阻止了PD-L1在肿瘤周围T细胞中的表达。因此，肿瘤细胞膜上PD-L1的存在与否在可能有不同的功能和治疗意义，这取决于PD-L1实际的表达机制。
免疫治疗药物被称为免疫检查点抑制剂，检查点蛋白与其伴侣蛋白结合可以阻止抑制信号被发送至T细胞，从而使它们保持活化状态以杀死癌细胞。美国食品和药品监督管理局（FDA）于2011年批准了第一种针对CTLA 4免疫检查点抑制剂伊匹单抗（ipilimumab，Bristol-Myers Squibb），治疗黑色素瘤。自从2014年美国食品和药品监督管理局（FDA）批准首个抗PD-1抗体pembrolizumab （Merck）后，FDA陆续批准了多种针对PD-1或PD-L1的治疗性单克隆抗体。这些药物可用于治疗各种肿瘤，包括Merkel细胞癌，霍奇金淋巴瘤，非小细胞肺癌，肾癌，膀胱癌，头颈部癌，胃癌和肝细胞癌等等。其中一些检查点抑制剂阻断PD-1（例如帕博利珠单抗Pembrolizumab, 纳武利尤单抗Nivolumab, 西米普利单抗Cemiplimab），而另一些则抑制PD-L1（例如阿特朱单抗，Atezolizumab，阿维鲁单抗Avelumab，德瓦鲁单抗Durvalumab）。
免疫检查点抑制剂的发展改变了多种晚期肿瘤的治疗模式。尽管在一部分病例中效果显著，疗效非常持久，但大多数患者没有治疗反应。有趣的是，偶尔会有PD-L1阴性的患者也可能从这种疗法中获益。肿瘤采用PD-1/PD-L1路线进行免疫逃逸，以促进自身生长和进展，但它也可能作为免疫检查点抑制剂的潜在治疗靶点。然而，这些治疗药物成本很高，还有显著的副作用。因此，在开始治疗之前，必须评估肿瘤细胞PD-L1的表达量是否增加。在此基础上，肿瘤或免疫细胞上的PD-L1蛋白表达量已成为对免疫检查点抑制剂治疗敏感的潜在预测生物标志物。
PD-L1 表达量可能通过各种可用的诊断技术来识别和测量。例如博鱼·体育官网，在晚期癌症中，血浆PD-L1蛋白水平可以作为监测PD-L1表达的手段。酶联免疫吸附剂检测（PD-L1-ELISA）可以在血浆中定量或定性地分析PD-L1。此外，Western blot 也有助于检测组织匀浆中的特定蛋白质。靶向NGS panels的突变发现以及mRNA和micro RNA的研究，也能为癌症患者中关键免疫检查点的各个组成部分的表达水平提供有价值的线索。然而，免疫组织化学是研究肿瘤中PD-L1表达的唯一广泛、实用和经济的方法。此外，该技术有助于识别可能受益于PD-1/PD-L1抑制剂治疗的患者。
许多商品化的PD-L1免疫组织化学检测可用于筛选检查点抑制剂治疗的患者。经过一系列临床试验后，FDA批准了一些不同的免疫组化平台与多种PD-L1抗体来评估PD-L1在肿瘤细胞、肿瘤浸润性免疫细胞上的表达，或两者兼而有之。在FDA注册的四个PD-L1免疫组化检测方法，分别是在两个免疫组化平台（Dako和Ventana）上使用了四种不同的PD-L1抗体（22C3博鱼·体育官网、28x8、SP263、SP142），每个平台都有特定的评分系统。这些PD-L1抗体可作为预包装试剂盒在批准的平台上使用，在使其获FDA批准的临床试验中，使用的是特定的免疫检查点抑制剂与特定的诊断检测试剂。这些检测中的每一种都使用其独特的抗体与专有试剂，实验方法和阈值来定义PD-L1的阳性表达。
这些试验使用了两种类型的检测方法：第一，伴随诊断检测，它为安全有效地使用相应的药物提供了必要的信息。第二，补充性检测，可能会有所帮助，但在选择特定药物治疗的患者时没有决定性作用。例如，PD-L1 IHC22C3 pharmDx的检测大部分为伴随诊断状态。另一方面，PD-L1IHC 28-8 pharmDx, Ventana PD-L1 SP142和Ventana PD-L1SP263检测则是补充诊断，而最近批准的伴随检测是使用 PDL1 IHC28-8 pharmDx来检测转移性非小细胞肺癌。
有一些更便宜的抗体也用于PD-L1 染色，它们采用不同的染色平台和实验方式，具有不同的评分和阈值来评估疗效，。这些生物标志物检测需要使用特定公司染色平台上运行的专门预包装试剂盒来实现标准化和验证博鱼·体育官网。最近的研究表明，除了Ventana SP142试剂盒检测到的肿瘤细胞明显少于其他检测方法以外，多个检测试剂盒（Dako 22C3、Dako 28-8、VentanaSP263）可以在多个设定环境中互换使用。散装的抗体克隆，如 Abcam 28-8、Cell Signalling E1L3N 等，比预包装的同类产品便宜。这些已被建议作为可能的替代品，并在不同的染色平台上验证，没有质量问题。PD-L1的检测必须可重复，包括染色技术程序和病理医生对检测结果的判读。组织固定和处理等前处理过程会显著影响免疫组织化学反应的结果，并可能影响不同的PD-L1 IHC检测的结果。
肿瘤细胞显示任何强度的膜着色都被认为是阳性。开发与临床相关和可重复的PD-L1评分方法以识别哪一患者将有效地响应抗PD-1治疗是建立伴随诊断或补充诊断检测的关键。非小细胞肺癌中PD-L1 IHC 22C3 PharmDx 的评分方法包括捕获特定肿瘤细胞比例评分 （TPS），该百分比与非小细胞肺癌配合良好。然而在随后的胃癌和其他癌症的治疗中，TPS在识别反应者方面有效率不高，因为它在计算分数时不包括肿瘤周围免疫细胞。然而，其他数据表明，肿瘤和肿瘤相关免疫细胞上的PD-L1染色与某些肿瘤的临床结果具有显著的相关性。因此，便开发出使用综合阳性分数（CPS）来评估一个区域的癌细胞和免疫细胞的方法。CPS 取决于 PD-L1 阳性细胞（包括肿瘤细胞、淋巴细胞和巨噬细胞）的数量与总的肿瘤细胞数量相关，允许单独量化肿瘤和免疫细胞。第三种方法使用PD-L1在肿瘤周围免疫细胞（IC）中的表达比例来评估，即肿瘤区域中任何强度的PD-L1阳性免疫细胞所占的肿瘤区域比例（图15）。在肿瘤相关的免疫细胞中，膜或细胞质染色都被认为是阳性的。
图9. PD-L1 染色肿瘤的示意图。图中有37个肿瘤细胞，其中14个为膜染色（图9的中间部分）。此外，（右下角）有10个肿瘤免疫细胞，包括一个巨噬细胞，对PD-L1呈阳性表达。在此基础上，可以计算肿瘤阳性评分（TPS） 和肿瘤细胞和免疫细胞联合阳性评分（CPS）。
TPS=14（阳性肿瘤细胞数量）/37（肿瘤细胞总数）×100=37.8
CPS=24（所有阳性细胞数量）/37（肿瘤细胞总数）×100=64.8
图10. 肺腺癌病例，实体型。PD-L1 的免疫化学染色显示肿瘤细胞异质性，着色强度范围从 1+ 到 3+ 。TPS：100（DAKO 22C3 抗体）。
图11A. 一例口腔黏膜鳞状细胞癌。B .PD-L1 的免疫化学染色，显示肿瘤细胞（图右侧）和肿瘤免疫细胞（图左侧）的染色博鱼·体育官网。CPS：90（DAKO 22C3 抗体）。
图12 A. 低分化胃腺癌病例。B. 肿瘤的免疫组化染色显示肿瘤免疫细胞着色，而肿瘤细胞则呈阴性。CPS：20（DAKO 22C3 抗体）。
图13.中分化胃腺癌病例。B. 免疫组化显示，只有肿瘤细胞对PD-L1呈阳性：而肿瘤免疫细胞是阴性的。CPS：80（DAKO 22C3 抗体）。
图 14. PD-L1阳性肿瘤在肿瘤细胞区域渗透免疫细胞（以红色边框标记）的表达图（以黑色虚线标记）。任何强度的PD-L1阳性免疫细胞占据的肿瘤面积比例决定免疫细胞（IC）评分
用于验证PD-L1检测的原始临床试验均未使用细胞学标本。但近年来发表了几篇使用细胞学标本研究的文献报道。这些研究表明，足够的细胞块（超过100个肿瘤细胞）可能适合于PD-L1检测，并可以提供同样可靠的结果。当由于患者的病情或其他情况而无法进行创伤性检查时，这种途径可能是有利的。在这种情况下，病理医生可以对肿瘤进行诊断，并在仅基于细胞学的基础上提供PD-L1检测结果。大多数发表的研究使用由内镜支气管超声引导针吸（EBUS-FNA）或输液获得的非小细胞肺癌的细胞学标本。但是，在考虑使用临床试验中未正式验证的做法以确保患者得到适当和有效的治疗时，需要谨慎行事。
无论肿瘤细胞膜着色完整还是不完整，都被认为是阳性：然而，在腺样结构形成肿瘤中，仅限于腔缘的着色则应该判为阴性。在浸润性肿瘤细胞中，细胞膜以及细胞质着色被认为是阳性的。全身各处不同部位的组织细胞/巨噬细胞可能表达PD-L1。腺腔内的巨噬细胞可能是强阳性的，此时如果肿瘤细胞没有着色，还是应被视为阴性。细菌和细胞碎片可能会显示显著的阳性着色，在判读时应该引起注意。细胞内色素，如黑色素、含铁血黄素和炭末，会影响判读结果。
此外，当血小板表达PD-L1时，它们会聚集在碎屑或组织中从而表现出假阳性。在判读过程中，病理医生可能会遇到核着色，这不是评分系统的一部分。在偶然情况下，肿瘤周边间质或者肿瘤周围的组织细胞/淋巴细胞的表面可能看起来呈阳性，但在肿瘤中心部分却没有显著着色。这种边缘效应可能是由于肿瘤细胞抗原和邻近免疫细胞之间的直接相互作用而不是肿瘤细胞对PD-L1表达引起的改变。在细胞学标本中，当肿瘤细胞稀疏时，判读和评分将是一个挑战。一些细胞标本中可能含有过量的组织细胞和与其大小相当的肿瘤细胞，两者可能很难区分。无论活检的性质如何，仔细评估免疫组化结果，评估阴阳性对照，以及与含铁血黄素和阴性染色组织进行比较，可以最大限度地减少这些困难。
PD-1/PD-L1通路抑制是一个极有前途的革命性癌症治疗手段。在过去十年里，PD-1/PD-L1抑制剂在一些恶性肿瘤中进行了临床试验，并取得了相当大的成功。此外，它已显示出在多种肿瘤治疗中具有持续生存效益，位于癌症免疫治疗的前沿。不幸的是，正如肿瘤细胞可以免疫逃避，一些肿瘤也可能会进化，以抵抗PD-1/PDL1通路抑制疗法。因此，尽管有潜在的治愈可能，但也只有少数患者对PD-1/PD-L1通路抑制治疗有长期和持续的疗效。
此外，一开始有效，但缺乏长期疗效通常是由于肿瘤细胞获得了抵抗力，最终可能导致肿瘤进展。因此，对PD-1/PD-L1通路抑制的抵抗仍然是阻碍其进一步应用的重大挑战。然而，医学界正在作出重大努力，以克服现有治疗阻力，并改善临床副作用及将免疫介质毒性降至最低。
一些研究调查了新辅助化疗后PD-L1免疫染色的变化，并探讨了癌症患者化疗反应、预后和PD-L1表达之间的关系。新辅助化疗后PD-L1表达的升高可能与化疗反应改变和无进展生存期有关，但目前需要进行更多的研究来评估这些发现的重要性。
病理医生对PD-L1 免疫组化的人工判读可能存在误差。数字化病理学和人工智能在实验室日常工作流程中日益被采用，我们应该充分利用这些工具提高PD-L1免疫组化检测的准确性。最近的几项研究表明，自动化数字图像分析提供的准确性和一致性可与人工判读相媲美。因此，图像分析评分在今后可以作为病理医生在PD-L1结果判读中提供关键的帮助。
总而言之，免疫检查点抑制剂在治疗各种癌症方面取得了相当大的进展。PD-L1检测是一项非常有价值的技术，可以作为患者免疫治疗前的一种选择，其临床应用正在不断扩大和演变。
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